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mRNA在细胞质内的稳定性是调控基因表达的重要方式。细胞以mRNA降解的方式对过时的、突变有害的mRNA进行及时清除以保证基因的正确表达和细胞正常的生命活动。其中脱帽酶Dcp1/Dcp2在mRNA降解中起到主要作用，但对其降解mRNA的详细作用机制了解甚少。到目前为止，尚没有该基因市售的抗体出现，阻碍了对该基因机理的研究。本文目的是利用PCR方法，从人的胎肝文库中克隆到Dcp2基因，制备其多克隆抗体血清。实验结果显示，通过溴化氰偶联柱子对该多克隆抗体血清经纯化得到的多克隆抗体，用于Western Blotting 试验，可以检测到该蛋白内源性的表达；用于激光共聚焦定位实验显示该内源性蛋白定位在细胞核内；此抗体同时可用于免疫沉淀实验。因此Dcp2基因和多克隆抗体的获得，为进一步研究该基因的功能创造了条件。 相似文献
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家蚕丝胶蛋白基因1(ser-1)启动子的克隆及其活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
家蚕ser-1基因是中部丝腺中特异表达组织特异性基因。为研究家蚕ser-1基因在时空上的调控机制,用PCR的方法克隆了家蚕ser-1基因启动子并进行序列分析,进一步构建了由ser-1基因启动子驱动报告基因DsRed的新型表达质粒pSK-ser-DsRed-PolyA,并通过蚕体和家蚕BmN细胞进行了瞬时表达。结果显示,家蚕ser-1基因启动子的TATA框的保守序列为TATAAAA,位于-24～-30处,CAAT框位于-112～-115处;ser-1基因启动子可以驱动红色荧光基因DsRed在家蚕幼虫的中部丝腺组织和培养的BmN细胞中瞬时表达。 相似文献
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神经生长因子的研究是目前医学生物学研究的热点之一,其诱导瘤细胞的分化更引人注目。我们的研究发现,神经生长因子仅能诱导具有短神经突起的N型瘤细胞分化成神经元样的细胞。这些细胞均无N-myc扩增,均具有高、低亲和性神经生长因子受体。而对神经生长因子无反应的细胞系或为S型细胞,或缺少神经生长因子受体的表达,或有N-myc扩增。进一步研究发现,不同细胞类型代表着瘤细胞的不同分化方向。神经生长因子仅能诱导向神经元方向分化的细胞分化。分化的瘤细胞中,C-myc的表达明显下降,提示神经生长因子可能通过抑制C-myc的表达而促进分化。用基因重组技术,恢复瘤细胞中神经生长因子受体的表达,可部分恢复其对神经生长因子的反应。针对N-myc的反义基因调控,可促进其分化过程。对瘤细胞原位凋亡检测和细胞凋亡相关基因的研究表明:诱导分化过程中伴随着bcl-2表达的下降和瘤细胞凋亡的增加。 相似文献
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鱼类干扰素系统基因的克隆鉴定及其特征分析 总被引：2，自引：0，他引：2
干扰素 (IFN)系统是脊椎动物抵抗病毒入侵的第一道防御系统 .除了哺乳类 ,有关低等脊椎动物的IFN系统基因知之甚少 .在鱼类 ,近 40年来能证明IFN系统存在的证据主要有两个 :一是检测经病毒诱导后的多种鱼类机体和细胞 ,证明能产生类似哺乳类IFN的抗病毒活性物质 ;二是近年来 ,已经证明在少数几种鱼类中存在与哺乳类IFN系统基因Mx同源的基因 .以前的研究结果表明 ,紫外线灭活的草鱼出血病病毒 (GCHV)能够诱导鲤科鱼类培养细胞 ,如鲫鱼囊胚细胞 (CAB)产生类IFN活性物质 ,并建立宿主细胞的抗病毒状态 .为了揭示鱼类培养细胞抗病毒免疫的分子机制 ,首先建立了一个研究鱼类抗病毒免疫相关基因的细胞模型系统 ,通过用灭活GCHV诱导CABIFN并进行理化、生物学特性鉴定的基础上 ,成功建立了一个囊括鱼类细胞抗病毒基因在内的差减cDNA文库 .其次 ,筛选文库揭示了一批与哺乳类IFN系统基因同源以及找不到同源性的EST ,表达分析证实它们也是IFN刺激基因 .再次 ,根据哺乳类IFN系统研究的最新进展 ,从该细胞模型系统中克隆、鉴定了 1 9个IFN系统基因的全长cDNA序列 ,包括鲫鱼IFN基因 ,IFN信号传导通路基因STAT1 ,IFN诱导表达调控基因IRF7,IFN行使抗病毒作用的效应基因Mx1、Mx2、PKR、Viperin、IFI5 6,以及一些功能未知的 相似文献
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根据鸡白细胞介素18（IL-18）cDNA基因序列设计了1对特异性引物，应用RT-PCR技术，从脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的我国地方品种萧山鸡原代鸡脾细胞中扩增并克隆鸡IL-18全长基因（Genbank accession，AY628648）。扩增片段全长591bp，共编码197个氨基酸的前体蛋白，其中含有表达完整功能蛋白所必需的起始密码子和终止密码子。该序列与国外报道的鸡IL-18全长基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性为98．99％。只在引导序列中出现两个氨基酸残基的缺失，分子进化分析表明萧山鸡IL-18基因与火鸡以及家鸭基因形成一个独立的分支。将萧山鸡IL-18成熟蛋白序列插入pGEX-4T-2载体并在Ecoli中得到表达，获得45kD的GST-IL-18融合蛋白。经纯化后用于制备多克隆抗体。本研究对萧山鸡白细胞介素18的全长基因进行了克隆及表达，并对其分子进化进行了分析。为深入研究其功能奠定了基础。 相似文献
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《黑龙江科技信息》2020,(23)
肺癌是当今世界上最受关注的癌症之一,其发病率逐年上升,死亡率极高。本论文将要对非小细胞癌中的肺腺癌进行研究,该类型是肺癌中发病率最高的种类,其癌细胞的浸润性强,因此常会破坏胸膜的正常组织及功能,引起胸腔积液。我所研究的CALCRL基因是一种蛋白质编码基因,属于细胞表面受体中最大的家族G-蛋白偶联受体的成员,它通过多种相关的信号通路参与调节重要的生命活动,如参与细胞增殖、细胞凋亡等。肿瘤组织是由于细胞恶性增殖与凋亡程序发生异常所造成的,而该基因表达产物具有调节细胞增殖与凋亡的功能,因此本论文将把该基因所参与的调节细胞增殖与凋亡的细胞通路作为重点展开研究。本研究主要使用TCGA、human protein atlas、Kmplotter数据库初步探讨CALCRL的在肺腺癌中的表达及其与患者生存预后的关系,研究其在肺组织中高度表达对于患者生存率的影响,该基因将有可能成为肺腺癌的靶向治疗目标或早期的诊断依据。 相似文献
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目的:构建真核表达IL-18-GPI融合基因的表达载体,观察融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达动力学及生物学活性,为进一步研究细胞因子作为免疫增强剂在临床肿瘤治疗中的应用奠定基础.方法:通过RT-PCR的方法从脂多糖刺激的外周血淋巴细胞中钓取IL-18基因,通过共用限制性酶切位点与GPI相连形成pcDNA-IL-18-GPI真核表达质粒.将质粒转染CHO细胞后建立稳定表达融合蛋白的细胞株用于融合蛋白的提取.对提取纯化的蛋白进行生物学特性、蛋白质转移分析和γ-IFN诱导实验.结果:获得714 bp的核酸序列并构建重组质粒pcDNA-IL-18-GPI.SDS-PAGE和West-blot显示在CHO细胞中表达的IL-18-GPI融合蛋白分子量约为27.5 kD,该蛋白具有明显的蛋白转移和诱生γ-IFN的作用.结论:IL-18-GPI融合蛋白是一种潜在的肿瘤疫苗增强剂,具有良好的应用前景. 相似文献
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hCLP46(human CAP10-like protein46)是从MDS-AML患者的CD34+干细胞cDNA文库中筛选出的基因.我们利用串联亲和纯化技术来筛选与hCLP46有相互作用的蛋白.通过体内交联-甘氨酸洗脱策略,检测到7条有差异的蛋白带,经液相色谱-质谱联用鉴定,得到了CNX和PDI等一系列内质网伴侣蛋白.所以hCLP46可能是一个糖蛋白,其成熟过程利用了BiP/Grp94和CNX/CRT 2套伴侣蛋白系统. 相似文献
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肿瘤多药耐药 (multidrugresistance ,MDR)是临床化疗成功最为严重的障碍 .首先阐明了新拓扑异构酶II抑制剂沙尔威辛对MDR肿瘤细胞直接的细胞毒性作用及下调mdr 1基因和P 糖蛋白的作用 .沙尔威辛能有效杀伤MDR细胞株 ,如K5 62 A0 2 ,KB VCR和MCF 7 ADR细胞 ,其杀伤能力与对相应亲本细胞相当 ,而明显强于几种临床常用的抗癌药物 .沙尔威辛下调mdr 1基因和P 糖蛋白的表达 ,但并不影响MRP和LRP基因 .其次 ,揭示了转录因子c jun的激活 ,在沙尔威辛下调K5 62 A0 2细胞内mdr 1基因表达及诱导凋亡过程中起着关键作用 .沙尔威辛增加K5 62 A0 2细胞的c jun表达明显早于其减少mdr 1基因的表达 ;c jun反义寡核苷酸消除沙尔威辛升高c jun蛋白、下调mdr 1基因表达的作用 .沙尔威辛还促进JNK和c jun磷酸化并增强转录因子AP1的DNA结合活性 .此外 ,c jun反义寡核苷酸还抑制沙尔威辛的凋亡诱导和细胞毒性作用 .最后 ,进一步研究发现沙尔威辛本身不引起MDR表型 .成功建立了对沙尔威辛具有 8 91倍耐药的A5 4 9 SAL细胞株 .该细胞株对抗代谢药产生 6.70倍的耐药 ,但对多种其他天然来源的抗肿瘤药物、烷化剂以及铂类化合物则缺乏交叉耐药性 . 相似文献
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利用离体转录载体ｐＳＰ１８、ｐＧＥＭ－３Ｚ和萤火虫荧光素酶基因（Ｌｕｃ）及其缺失片段构建了一组融合质粒。以这些质粒为模板，通过离体转录产生荧光素酶基因的ｍＲＮＡ，反义ＲＮＡ及大小和结构不同的反义ＲＮＡ缺失片段，再通过显微注射分别将其引入爪赡卵母细胞的细胞质。注射后的卵母细胞经一定时间培育，然后检测其翻译产物一荧光素酶的相对活性。结果表明，荧光素酶基因的表达受反义ＲＮＡ及其缺失片段的严重阻抑，表达抑制和反义ＲＮＡ之间存在明显的剂量效应。而且，基因表达的抑制程度主要的和反义ＲＮＡ片段的结构有关。 相似文献
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BackgroundMolecular brain therapies require the development of molecular switches to control gene expression in a limited and regulated manner in time and space. Light-switchable gene systems allow precise control of gene expression with an enhanced spatio-temporal resolution compared to chemical inducers. In this work, we adapted the existing light-switchable Light-On system into a lentiviral platform, which consists of two modules: (i) one for the expression of the blue light-switchable trans-activator GAVPO and (ii) a second module containing an inducible-UAS promoter (UAS) modulated by a light-activated GAVPO.ResultsIn the HEK293-T cell line transfected with this lentiviral plasmids system, the expression of the reporter mCherry increased between 4 to 5 fold after light induction. A time expression analysis after light induction during 24 h revealed that mRNA levels continuously increased up to 9 h, while protein levels increased throughout the experiment. Finally, transduction of cultured rat hippocampal neurons with this dual Light-On lentiviral system showed that CDNF, a potential therapeutic trophic factor, was induced only in cells exposed to blue light.ConclusionsIn conclusion, the optimized lentiviral platform of the Light-On system provides an efficient way to control gene expression in neurons, suggesting that this platform could potentially be used in biomedical and neuroscience research, and eventually in brain therapies for neurodegenerative diseases.How to cite: Zárate RV, Arancibia D, Fernández A, et al. Optimization of the Light-On system in a lentiviral platform to a light-controlled expression of genes in neurons. Electron J Biotechnol 2021;51. https://doi.org/10.1016/j.ejbt.2021.03.006 相似文献
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This study reports a robust method of gene transfection in a murine primary cell model by using a high-density electrodes network (HDEN). By demonstrating high cell viability after gene transfection and successful expression of transgenes including fluorescent proteins, the HDEN device shows great promise as a solution in which reprogramming efficiency using non-viral induction for generation of murine induced pluripotent stem cells (iPSCs) is optimized. High and steady transgene expression levels in host cells of iPSCs can be demonstrated using this method. Moreover, the HDEN device achieved successful gene transfection with a low voltage of less than 180 V while requiring relatively low cell numbers (less than 1.5 × 104 cells). The results are comparable to current conventional methods, demonstrating a reasonable fluorescent-plasmid transfection rate (42.4% in single transfection and 24.5% in triple transfection) and high cell viability of over 95%. The gene expression levels of each iPSC factor was measured to be over 10-fold higher than that reported in previous studies using a single mouse embryonic fibroblast cell. Our results demonstrate that the generation of iPSCs using HDEN transfection of plasmid DNA may be a feasible and safe alternative to using viral transfection methods in the near future. 相似文献
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Nidhi Gupta Ramesh Kandimalla Kumari Priyanka Gagandip Singh Kiran Dip Gill Surjit Singh 《Indian journal of clinical biochemistry : IJCB》2014,29(1):69-73
Dietary and lifestyle factors have been shown to have a profound effect on paraoxonase-1 (PON1) activity. Cigarette smoke has been shown to inhibit its mass and activity where as resveratrol has been shown to enhance it. We exposed hepatoma derived cell line (HepG2) to resveratrol and nicotine in varying doses and measured PON1 enzymatic activity and PON1 gene expression. In addition, total protein content of HepG2 cells was also measured. Resveratrol in a dose of 15 μmol/l or above significantly increased the PON1 enzyme activity (p > 0.001) where as nicotine in a dose of 1 μmol/l or higher significantly reduced it (p < 0.05). The resveratrol in this dose also enhanced the PON1 gene expression whereas nicotine decreased it as compared to controls. However, the protein conent of cells was not changed suggesting that they were not cytotoxic in the doses used. Till date the antioxidant vitamins have shown disappointing results against LDL oxidation and cardiovascular protection. However, the effect of resveratrol on PON1 gene expression and activity was significant, suggesting increase in PON1 activity and enhanced gene expression may be its alternative mechanism for offering protection against cardiovascular disease and may be an potential pharmacological agent which can be used for this. 相似文献