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1.
目的：克隆人Lumican基因及构建Lumican基因真核表达载体并研究其对人子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖的影响。方法：取人新鲜正常子宫内膜组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增Lumican基因,将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建真核细胞表达载体pEGFP-N1-Lumican,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的Lumican基因通过脂质体介导下转染人子宫内膜癌细胞HEC-1A;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot 检测转染细胞HEC-1A的Lumican mRNA和蛋白表达。采用MTT法观察转染Lumican基因的人子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖能力。结果：重组质粒pEGFP-N1-Lumican经HindⅢ和BamHⅠ酶切,获得8311 bp片段和865 bp插入片段,序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致;荧光显微镜下可见转染的HEC-1A细胞有绿色荧光蛋白的表达;转染细胞HEC-1A的Lumican mRNA表达上调,Lumican蛋白相对上调率为74．62％（P＜0．05）。与对照组细胞比较,转染Lumican 基因的人子宫内膜癌细胞HEC-1A的抑制率为21．35％±2．78％。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Lumican,该载体在体外能有效抑制人子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖能力,为以Lumican基因为靶点研究其对人子宫内膜癌细胞HEC-1A的恶性生物学特性提供实验基础。 相似文献
2.
采用PCR方法扩增对虾白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因,插入到pGEX-4T-2表达载体上构建出带有目的基因的重组质粒pGEX-4T-2RR,然后将重组质粒转化大肠杆菌.转化菌经IPTG诱导后大量表达重组蛋白,通过降低诱导温度获得可溶性表达的重组蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白. 相似文献
3.
克隆、构建弹状胭脂鱼弹状病毒糖蛋白基因重组质粒,并进行表达和鉴定.用RT-PCR方法扩增出大小为1.5kb的CSRV-G基因片断,构建重组克隆质粒pRSET-C/CSRV-G,并将其转化进入大肠杆菌DH5α原核表达系统,酶切鉴定证明重组质粒的正确性.经IPTG诱导后表达重组蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行分析鉴定,诱导后能够表达预期的分子量为55 kD的融合蛋白. 相似文献
4.
《东南大学学报》2015,(3)
为制备可视化的转移消失蛋白(MIM)的I-BAR结构域重组体,克隆了顺联绿色荧光蛋白(GFP)探针编码序列的MIM-I-BAR基因.在6xHis标签原核表达质粒上成功构建了DNA序列.同时,实现了未标记荧光探针基因的MIM-I-BAR质粒的构建以作实验对照.成功转染至BL21(DE3)大肠杆菌细胞后,GFP偶联的MIM-I-BAR(MIM-I-BAR-GFP)蛋白表现出很强的可视荧光,该表达产物可方便的通过目测、荧光显微镜、免疫印迹和紫外可见分光光度计等多种手段进行检测.此外,在考察不同条件下的蛋白表达效率过程中发现,带有GFP探针的MIM-I-BAR重组蛋白在温度为10℃时产率最高,而并非37℃.这一特征与非荧光标记的MIM-I-BAR明显不同.研究证实该最佳表达温度条件适用于重组蛋白产品中量制备.所开发的带有荧光探针的MIM-I-BAR蛋白产品及其制备工艺在科学研究、生物医学应用以及药物开发过程中均有较高的应用价值. 相似文献
5.
通过PCR技术扩增出人铁蛋白基因,经酶切后与表达载体质粒pGEX-4T-2连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌,利用菌落PCR、质粒双酶切、测序,证实成功地构建了人铁蛋白基因表达载体,利用IPTG对重组菌进行诱导表达,通过尿素洗涤纯化目的蛋白用于制备抗体． 相似文献
6.
核基质结合蛋白SATB1调控染色质的空间结构,参与真核生物基因表达。本论文通过PCR获得SATB1目的基因,然后与载体mCherry-C1同时用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后,用T4连接酶进行连接。连接质粒转入感受态宿主细胞并在Kana抗性的LB培养基中培养。分离获得Kana抗性单克隆菌株并进行扩大培养后提取重组质粒。对重组质粒进行双酶切验证和DNA测序检测。本论文成功构建mCherry-SATB1真核表达质粒,为后续研究SATB1的功能机制奠定基础。 相似文献
7.
本文选取βhCG羧基端37肽(βhCG CTP37)的序列和βhCG109-118十肽重复6次的多聚表位,插入到真核表达质粒载体pCR-HBc乙肝核心抗原的第80位氨基酸中,构建重组质粒pCR-HBc-X6-βhCGCTP37,将其转染CHO细胞,在转染细胞裂解物中发现存在特异性表达产物,说明构建的DNA疫苗具有进一步动物免疫的价值. 相似文献
8.
建立共表达人μ阿片受体（humanμ-opiatereceptor,hMOR,OPRM）与Gq蛋白的CHO-Flp In稳定细胞模型,并鉴定其药理学功能,可为体外高通量筛选靶向OPRM的药物奠定基础。该研究首先构建重组表达质粒OPRM-pcDNA5/FRT,并进行鉴定;然后通过脂质体转染法将OPRM-pcDNA5/FRT、GqG66Di5-pIRES/puro3和FLP重组酶质粒POG44共转染CHO-Flp In细胞,经抗性加压和有限稀释法挑取耐药单克隆,采用FLIPR钙信号检测方法筛选阳性克隆株;最后,通过RT-q PCR对细胞中的OPRM和GqG66Di5m RNA表达水平进行检测,并选用OPRM激动剂DAMGO和抑制剂Naloxone对稳定细胞株的药理学功能进行鉴定。结果显示：经酶切确定了重组质粒的正确构建;通过重组质粒转染、抗生素加压筛选以及钙信号测定获得22个具有活性的克隆细胞株,其中15号细胞株的荧光信号值最高,命名为Gq-OPRM1-CHO;与对照组相比,Gq-OPRM1-CHO细胞组中OPRM与GqG66Di5基因m RNA水平分别升高约400倍和120倍;在Gq-O... 相似文献
9.
孙晓东 《陕西教育学院学报》2010,26(2):106-107,121
为了构建人C6orf210基因原核表达载体,并在E．coliBL21中表达并纯化。采用RT—PCR扩增人C6orf210基因片段,并将其克隆到原核表达载体Pet21a中,构建重组质粒pET21a—C6ort210。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E．coliBL21,经IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示获得全长为1188bp的人的CAiorf210基因片段。以构建的重组质粒pET21a—C6orf210转化E．coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约66000的融合蛋白。经SINS—PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为C6orf210。 相似文献
10.
《莆田学院学报》2019,(2):16-20
观察Bmi-1基因沉默对A549细胞体外迁移和体内转移的影响。设计针对Bmi-1的小干扰RNA(siRNA)序列作为靶序列构建重组逆转录病毒siRNA表达载体并将其转染入肺腺癌A549细胞;应用RT-PCR和Western Blot方法检测对Bmi-1基因的沉默效果;应用划痕修复和Transwell方法检测Bmi-1-siRNA对A549细胞体外迁移的影响;通过裸鼠尾输入各组细胞,观察Bmi-1-siRNA对A549细胞在裸鼠体内转移能力的影响。结果显示:沉默Bmi-1基因的表达能够抑制A549细胞的体内外迁移能力,同时降低VEGF的分泌。Bmi-1-siRNA能抑制肺腺癌A549细胞的转移能力,VEGF可能参与其中。 相似文献