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1.
将人细胞周期蛋白D1基因克隆入原核表达载体pET-20b中获得重组质粒pET-20b-eyeD,经酶切鉴定正确后转化大肠杆菌BL21PlaysS后获得表达菌株．该菌株经IPTG诱导后表达的目的蛋白有部分分泌到培养基上清中,将培养基上清中的蛋白沉淀后用Ni^2＋螯合柱进行纯化,最后可得到纯度达到95％以上的目的蛋白．蛋白电泳显示纯化蛋白的分子量约为33KD,Westemblot分析表明,在电泳胶的相应分子量处出现特异性条带,说明已经成功表达和纯化了重组人细胞周期蛋白D1． 相似文献
2.
绿僵菌是一类广泛应用于生物防治的昆虫病原真菌.研究表明小RNA能够调控基因的表达,其中Argonaute基因在整个小RNA通路中发挥重要的作用.本研究通过RT-PCR的方法从绿僵菌中获得了Argonaute基因的部分功能片段,构建了其重组原核表达载体,将重组载体转化至大肠杆菌进行诱导表达;采用镍柱亲和纯化重组的目的蛋白并通过Western blot技术鉴定.结果发现：通过RT-PCR的方法获得长度约为950bp的基因片段;重组原核表达载体经诱导表达后,SDS-PAGE检测发现分子量约为34kDa的目的蛋白条带;诱导5h后蛋白的表达量最高,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,经Western blot技术检测,重组蛋白可与His-tag抗体发生特异性反应.该纯化重组蛋白的获得为将来绿僵菌Argonaute蛋白抗体的制备,并进一步通过该抗体获得绿僵菌体内的小RNA及其靶基因提供了基础. 相似文献
3.
研究用亲和融合谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)的方法纯化重组人白细胞介素 6(IL 6)的发酵和纯化工艺 ,使用含有质粒pHZl818的E .coliJMl0 9在 2XYT培养基中进行发酵表达 ,IL 6表达为与谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合的融合蛋白GST IL 6.融合蛋白存在可溶的活性蛋白和不可溶的包含体两种形式 ,此包含体无活性且无法复性 ,无法用亲和层析回收 ,通过实验优化摇床发酵的诱导温度和转速 ,以增加可溶融合蛋白的表达 .菌体超声破碎液后 ,上清液用作亲和柱层析 ,可将融合蛋白提纯至 80 00 ,每升发酵液可得 10mg融合蛋白 ,用凝血酶裂解处理 6h ,亲和标志物GST被特异性切除 ,裂解得到的IL 6用离子交换柱层析可纯化至 95 00 ,MTT法测得纯化的IL 6生物学活性为 1.0 2× 10 8IU/mg . 相似文献
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《赣南师范学院学报》2021,(6):74-77
柑橘黄龙病菌CpaB基因编码一种菌毛组装蛋白(Flp pilus assemble protein),前期研究已经证实该蛋白具有外分泌性.在本研究中,首先构建pET30a-CpaB重组载体,然后将其转化BL21(DE3)感受态细胞,重组菌在37℃,0.2 mmol·L(-1) IPTG诱导下,CpaB蛋白可被成功诱导表达,经过Ni-NTA亲和柱纯化后,获得纯度较高的CpaB重组蛋白,分子量为28.2 kDa,以其为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗血清;采用Western blot对多抗血清的特异性进行分析,结果显示该多抗能特异性结合纯化的CpaB蛋白;进一步使用制备好的CpaB抗血清对感染黄龙病和健康的柑橘样品进行DTBIA检测,具有较好的区分度.这些研究结果为柑橘黄龙病快速检测体系的建立提供理论参考. 相似文献
5.
目的:在大肠杆菌(BL21)中构建可溶性表达的金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)受体拮抗剂。方法:首先确定SEB受体桔抗剂的基因序列,然后用含有SEB受体桔抗剂的基因序列重组质粒表达载体PGEX-4T-1转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达获得蛋白,产物经GST柱纯化后,利用ELISA检测其与SEB的结合能力并进行其体内外药效学实验。结果:该质粒成功转化为可溶性表达,ELISA结果显示表达产物可与SEB特异性结合。结论:本研究成功对SEB受体拮抗剂GST可溶性表达并对其活性进行初步分析。 相似文献
6.
本实验对重组PyNPase基因工程茵诱导表达,超声波破碎后上清波进行了分离与纯化,采用革兰氏染色法观察和活茵计数法检测破碎效率。超声波破碎上清液经Ni-亲和层析进行分离纯化,最后用SDS—PAGE和磷酸化反应进行了鉴定。结果表明,高效表达的PyNPase重组茵,在工作5s,间歇5s,工作50min,破碎效率最佳。SDS—PAGE检测电泳纯度达到85％以上,条带模糊;分离获得的PyNPase能使尿苷磷酸化为尿嘧啶,具有磷酸化酶活性,但上清液中可溶性PyNPase的含量比较低。 相似文献
7.
以对虾白斑病毒DNA为模板扩增出Vp28基因,经限制性内切酶（SmaI,Not I）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Vp28基因原核表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约52kD相吻合的融合蛋白带,18℃诱导24h后获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白． 相似文献
8.
从假单胞菌（Pseudomonassp．）XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌（Escherichiacoli）中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础．以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框（0RF）克隆至融合表达载体pET30a（＋）进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析．实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E．coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20％;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92％以上．表达蛋白具有良好活性． 相似文献
9.
采用PCR方法扩增对虾白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因,插入到pGEX-4T-2表达载体上构建出带有目的基因的重组质粒pGEX-4T-2RR,然后将重组质粒转化大肠杆菌.转化菌经IPTG诱导后大量表达重组蛋白,通过降低诱导温度获得可溶性表达的重组蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白. 相似文献
10.
泥蚶肌肉提取液经硫酸铵二步分级沉淀后,再经DEAE-Sepharose（Fast Flow）离子交换和SephacrylS-200-HR分子筛层析,从中分离纯化得到泥蚶肌肉凝集素．经测定,该凝集素分子量约为238kDa,为单个亚基的蛋白质,其相对分子量为60kDa,分子中含3．27％的糖．在氨基酸组成中,谷氨酸（Glu）含量最高,其次是丝氨酸（Ser）和天门冬氨酸（Asp）．泥蚶肌肉凝集素对人和动物红细胞均有凝集作用,其中对兔的红细跑的凝集活性最高．该凝集素对兔的红细胞的凝集活性不被测试的10种浓度为200mmol·L^-1的糖所抑制．pH6．0～7．0时具有较强活性;热稳定性较高,在30-50℃的温度范围内对兔红细胞的凝集仍保持原有活性,60℃以后活力下降;凝集活性依赖于Ca^2＋． 相似文献
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孙晓东 《陕西教育学院学报》2010,26(2):106-107,121
为了构建人C6orf210基因原核表达载体,并在E．coliBL21中表达并纯化。采用RT—PCR扩增人C6orf210基因片段,并将其克隆到原核表达载体Pet21a中,构建重组质粒pET21a—C6ort210。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E．coliBL21,经IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示获得全长为1188bp的人的CAiorf210基因片段。以构建的重组质粒pET21a—C6orf210转化E．coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约66000的融合蛋白。经SINS—PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为C6orf210。 相似文献
12.
利用RT-PCR技术从日本对虾中克隆到β-actin基因的cDNA,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,获得阳性克隆.4℃下IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B纯化后获得高纯度的β-actin蛋白.① 相似文献
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INTRODUCTION The difficulties associated with large-scaleproduction of biotherapeutics provide a constantchallenge to the biotechnology industry. FDA hadadded “therapeutic DNA plasmid vectors” to the listof well-characterized biotechnology product (DoHHs,1996), and gene therapy has moved rapidly fromlaboratory scale to clinical trials. It is urgent to de-velop new protocols to obtain high-quality plasmidswith high yields and minimal or no contamination ofRNA and chromosomal D… 相似文献
14.
Zhong-hui ZHANG Li-juan DU Di XIANG Shun-ying ZHU Ming-yuan WU Hui-li LU Yan YU Wei HAN 《Journal of Zhejiang University. Science. B》2009,10(2)
Midkine is a heparin-binding growth factor,which plays important roles in the regulation of cell growth and differentiation.The non-tagged recombinant human midkine (rhMK) is therefore required to facilitate its functional studies of this important growth factor.In the present work,rhMK was expressed in Escherichia coli (E.coli) BL21 (DE3).The expression of midkine was efficiently induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG).After sonication,midkine was recovered in an insoluble form,and was dissolved in guaoidine hydrochloride buffer.Renaturation of the denatured protein was carried out in the defined protein refolding buffer,and the refolded protein was purified using S-Sepharose ion-exchange chromatography.The final preparation of the rhMK was greater than 98% pure as measured by sodium dodecylsulfate-polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) and reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC).The purified rhMK enhanced the proliferation of NIH3T3 cells. 相似文献
15.
根据GenBank数据库中猪圆环病毒Ⅱ型的基因组序列设计引物,采用PCR技术从病料基因组DNA中扩增出PCVⅡ河南地方株ORF4基因,全长180 bp,编码59个氨基酸.将该基因克隆至载体pGEX-4T-3中形成pGEX-4T-3-ORF4表达载体.经PCR、酶切和测序鉴定后,转化表达菌株BL21（DE3）诱导表达.SDS-PAGE结果显示：ORF4能够在大肠杆菌中表达,产物的分子量约为32 kD,且以包涵体形式存在.Western Blot检测结果显示,纯化后的ORF4蛋白能够与鼠抗6＆#215;His标签单克隆抗体发生特异性反应,为进一步研究PCVⅡORF4蛋白的特性与功能奠定了基础. 相似文献
16.
《天津大学学报(英文版)》2015,(1)
The Bacillus strain BH072 isolated from a honey sample showed strong antifungal activity against phytopathogen. Gene cloning test demonstrated that the strain had a tas A gene encoding an antifungal Tas A protein. Although the wild strain simultaneously produced various antifungal substances, only the physicochemical property and antifungal activity of Tas A protein were unclear due to the difficulty in extraction. In this study, tas A gene encoding the protein from Bacillus sp. BH072 was amplified by using the polymerase chain reaction(PCR) method and cloned into p ET 28a(+) vector, and then expressed in host cells Escherichia coli BL21(DE3). The expressed proteins were collected by centrifugation and ultrasonic treatment, and then purified by using nickel-nitrilotriacetic acid(Ni-NTA)metal affinity column and dialysis methods. The result of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) test showed that an expected protein band appeared with a size of 31 k Da. The expressed products possessed antifungal activity against the phytopathogenic indicator strain Botrytis cinerea. A genetically engineered strain tas A of E. coli was established in this study which can efficiently express Tas A protein. 相似文献
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人酸性成纤维细胞生长因子cDNA的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
目的：研究人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）cDNA在不同表达系统中的表达，旨在得到高效表达haFGF的表达系统。方法：采用PCR方法扩增人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF）cDNA，将该cDNA片段分别插入表达载体pKK223-3及pET3C的表达框架中，筛选得到了重组质粒pKK223-3-haFGF及pET3C-haFGF，分别转化大肠杆菌JM109及BL21（DE3），构建了表达菌株JM109/pKK223-3-haFGF及BL21(DE3)/pET3C-haFGF,用IPTG诱导表达。结果；SDS-PAGE的结果表明，表达菌株BL21(DE3)/pET3C-haFGF能高效表达人酸性成纤维细胞生长因子，而JM109/pKK223-3-haFGF诱导后目标蛋白带不明显。结论：BL21（DE3）/pET3C表达系统更适于表达人酸性成纤维细胞生长因子。 相似文献