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1.
红松SRAP-PCR反应体系的建立及优化 总被引：1，自引：0，他引：1
相关序列扩增多态性(Sequence-Related Amplified Polymorphism,SRAP)是对ORFs(OpenReading Frames)进行扩增的一种新型的基于PCR的标记方法。以CTAB法提取的红松针叶DNA为模板,应用单因子试验及L16(45)正交试验系统分析了DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度等对SRAP-PCR扩增结果的影响。确定了PCR的最佳反应体系为:20μL体系中,1×PCRbuffer 2μL、DNA模板40~100 ng,Mg2+2.5mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.15μmol/L,Taq酶1.5 U。PCR最优的扩增程序为:进行35个循环,前5个循环中94℃变性1 min,35℃复性1 min,延伸30 s;后30个循环中94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸1 min;最后72℃延伸7 min,4℃保存。在此反应体系下,所扩增谱带清晰、稳定、多态性高,为进行红松不同种源间遗传分化以及构建遗传图谱等内容的研究奠定基础。 相似文献
2.
在研究猪分子标记遗传距离同杂种优势的关系时,对模板浓度和纯度、引物浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、不同商标的Tag酶等影响RAPD扩增的因素进行了系统的分析,在此基础上建立了适宜于本实验室研究的最佳RAPD技术体系:25(1反应体系中,含10×buffer2.5(I,MgCl21.75mmol/L,dNTPO25mmol/L,引物0.24(mol/L,Tag酶2U,模板50～100ng,1(g/(IBSA。反应程序为:94℃预变性5min,然后94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min40个循环,最后在72℃延伸10min。 相似文献
3.
建立并优化虎耳草ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨虎耳草种质资源遗传多样性奠定基础.采用正交设计方法和单因子试验,研究TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg2+、引物、模板DNA、延伸时间及循环次数对PCR扩增的影响.结果表明:虎耳草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在25μL的反应体系中含模板DNA 35ng,Mg2+1.25mmo/lL、dNTP 380μmo/lL、引物1.2μmo/lL、Taq DNA聚合酶1.5U.反应程序为:95℃预变性5min;94℃变性1min,50℃(据不同引物的退火温度)退火70s,72℃延伸1.5min,40个循环;72℃延伸10min,4℃保存.经过11份虎耳草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于虎耳草种质资源遗传多样性分析及居群鉴别的研究. 相似文献
4.
本研究以辣椒基因组DNA为模板,优化辣椒SRAP反应体系中的参数,建立了一套适用于辣椒的SRAP-PCR最佳反应体系。在25μL反应体系中,模板DNA 50 ng、上下游引物各0.1μmol/L、dNTPs 0.1mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U、Mg2+浓度为2.0 mmol/L。扩增程序为:94℃3 min;94℃30 s、35℃30 s、72℃1.5 min,5 cycles;94℃30 s、54℃30 s、72℃30 s,35 cycles;72℃10 min,用2%琼脂糖凝胶电泳和8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果。利用该优化体系筛选引物,筛选出条带清晰、重复性好的15对SRAP引物组合,验证了体系的实用性。 相似文献
5.
正交设计在梨基因组RAPD优化体系中的应用 总被引：2，自引：0，他引：2
采用正交设计研究方法,建立了梨RAPD分析的PCR反应体系,成功地进行了RAPD扩增,筛选出梨RAPD的最佳方案为:25μl反应体系中包括引物0.5μmol.μL-1,dNTPs0.1mmol.L-1,模板DNA10ng,Taq酶1U,Mg2 4mmol.L-1,10buffer缓冲液2.5lμ,其余部分用无菌超纯水补平。PCR扩增循环为95℃3min,38℃1min,72℃2min1次循环;94℃1min,38℃1min,72℃2min,46次循环,最后72℃延伸10min。 相似文献
6.
席在星 《实验室研究与探索》2006,25(6):608-610,630
RAPD技术是一种新的分子标记技术,DNA质量是保证RAPD分析成功的关键。为获得高质量的木通属植物基因组DNA,本文采用SDS法、改良CTAB法、高盐低pH值法提取三叶木通总DNA。结果表明,高盐低pH值法不适用于木通属植物DNA的提取;改良CTAB法是合适的DNA提取方法,它们获得DNA模板纯度高、质量好,可直接用于RAPD分析。同时,对RAPD反应条件中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立适合木通属植物RAPD分析应用的体系,其组成为:反应液总体积为25μL,2.5μL 10×PCR缓冲液、0.16 mmol/L dNTPs2、.0 mmol/L Mg2 、0.64μmol/L引物、1 U/μL Taq酶4、0 ng/25μLDNA模板。PCR循环体系为:94℃,4 min-[-94℃,30 s-37℃,90 s-72℃,60 s-]-72℃,5 min,40个循环。 相似文献
7.
韩颖 《内江师范学院学报》2008,23(2):51-54
采用改进的CTAB法,成功地提取了北野豌豆及其近缘种的基因组DNA,电泳结果显示DNA质量和产量均较高,并以此DNA为模板,对ISSR的反应条件进行了优化,最终确定ISSR的反应体系为：总体积10μl,包括10ng的DNA,1倍的反应缓冲液,1．5mmol·L^-1MgCl2,2×10^-4mmol·L^-1（引物6和引物8）或2×10^-3mmol·L^-1（引物5,10和12）引物,0．2mmol·L^-1dNTP混合物和1．0U的Taq DNA聚合酶．ISSR扩增程序为：先在94℃下变性3min,然后在92℃下变性30s,50℃（引物5,6,10,12）或55．2℃（引物8）下复性30s,72℃下延伸1min,反应30个循环,最后72℃延伸5min．并基于此反应条件,最终筛选出5条ISSR引物用于进一步的研究． 相似文献
8.
采用一种类似PCR的基因组自我引发PCR(GSP—PCR)法，初步研究了家蚕、野蚕、天蚕、蓖麻蚕和柞蚕的微卫星DNA的体外基因组自我引发PCR扩增的条件。结果发现。浓度为100ng/μl的基因组DNA在100℃变性15min后，与等量的同浓度的未变性的DNA混合作为模板。在80m扩增体系中[含0．2mM dNTPs、50mM KCl、10mM Tris—HCl(pH9．0)、4mM MgCl2、1．25U Tap plymerase]，加入1μl此混合模板，在92℃，1min→55℃，2min→72℃，2min，30→90次循环的扩增条件下，成功地得到了PCR产物。基因组DNA的适宜浓度为1．25ng/μl反应体系；GSP—PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后的部分片段经回收后，在同样条件下，30—60个循环可得到同样大小范围的产物。GSP—PCR产物经6％的变性测序胶电泳，得到典型的梯状带，表明为微卫星DNA。 相似文献
9.
目的:对RAPD的反应体系进行优化,以期建立稳定的临床检测系统,在控制院内感染的流行病研究中发挥更大的作用.方法:用RAPD技术进行基因分型.结果:引物浓度:浓度为0.5μmol/L 时扩增最好.DNA模板:浓度在0.50ng/μl 、2ng/μl均得到了良好的扩增效果.镁离子浓度:在2.0mmol/L、4mmol/L时扩增效果较好.退火温度:在30℃时扩增条带最清晰.循环参数:在35、45个循环时扩增效果均好.结论:本试验对RAPD反应条件进行优化,建立了较稳定的临床检测体系. 相似文献
10.
以改进SDS法抽提濒危植物水杉嫩叶总DNA,进行随机扩增多态DNA(RAPD)分析,分别测试了镁离子,dNTP,模板DNA含量,引物和DNA聚合酶量对反应结果的影响,通过各因子的组合研究,可知水杉RAPD分析较适宜的扩增条件是:15μlPCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/LTris HCl pH 9,0.50mmol/L KCl,0.1％Triton X-100),1.5mmol/L MgCl_2,0.5U Taq酶(上海华美公司),5ng模板DNA,20pmol引物(上海Sangon公司);2μg/μlBSA;dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mmol/L。 相似文献