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1.
Chao LIU Xian ZHANG Zhi-ming RAO Ming-long SHAO Le-le ZHANG Dan WU Zheng-hong XU Hui LI 《Journal of Zhejiang University. Science. B》2015,(4)
目的：获得一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮（ AD ）的Mycobacterium neoaurum突变株。
创新点：获得了一株3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KSDD）酶活缺陷型的高产 AD的诱变菌株 Mycobacterium neo-aurum ZADF-4,并采用菌落显色法筛选 KSDD酶活缺陷型M. neoaurum突变株。
方法：（1）诱变方法：采用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术来处理出发菌株 M. neoaurum ZAD。ARTP 诱变条件如下：功率40 W ,气流量12.5 L/min,辐射距离1 cm,样品体积10μl,辐射时间为60、90、120、150和180 s;致死率统计优化后,最适辐射时间为150 s,致死率为90%~96%。（2）筛选方法：将ARTP诱变处理后的菌株点种在硝酸纤维滤膜上,30°C培养2 d,然后将长有菌落的滤膜小心取出并漂浮在4 mg/ml二氯靛酚（DCPIP）溶液（0.1 mmol/L磷酸缓冲液pH 7.0）,30°C培养1 d直到全部菌落染成蓝色。然后将该滤膜取出,漂浮在250 mmol/L AD溶液（2%甲醇和50 mmol/L Tris pH 7.0缓冲液）,室温放置15 min左右,观察菌落颜色变化。KSDD在底物 AD 存在时会脱氢产生雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）和H+,H+可以使被DCPIP染成蓝色的菌株褪色。因此,酶活缺陷型的菌株会仍保持蓝色,而酶活高的菌株会褪色为黄色（图3）。（3）对获得的潜在的高产AD菌株进行进一步的酶活检测以及产量验证,以期获得最优的突变株。
结论：获得了4株具有潜在的高产AD能力的菌株,其中,最优的突变株ZADF-4的KSDD酶活相较于出发菌株ZAD下降了81.2%（图4）,活性胶也证明其KSDD酶活相较于出发菌株下降明显（图5）。薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）实验证明突变株 ZADF-4中,AD的产量有了明显的提高（图6和图7）,提高到了(6.28±0.11) g/L, AD/ADD提高到8：1,AD的摩尔产率达到60.3%（表1）。对出发菌株ZAD和突变株ZADF-4的ksdd基因进行克隆和序列比对,发现ZADF-4的ksdd序列在5'端缺失9个核苷酸（atgttctac）,导致3个氨基酸（MFY）的缺失;还发生了两个点突变,其中一个是无义突变（g.15a>6t）,另一个是有义突变（g.413c>404t）,并引起了相应位置上的氨基酸变化（p.138S>135L）。上述的基因突变及其引起的氨基酸序列的变化可能是引起M. neoaurum ZADF-4中KSDD酶活降低及AD产量提高的主要原因。 相似文献
创新点：获得了一株3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KSDD）酶活缺陷型的高产 AD的诱变菌株 Mycobacterium neo-aurum ZADF-4,并采用菌落显色法筛选 KSDD酶活缺陷型M. neoaurum突变株。
方法：（1）诱变方法：采用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术来处理出发菌株 M. neoaurum ZAD。ARTP 诱变条件如下：功率40 W ,气流量12.5 L/min,辐射距离1 cm,样品体积10μl,辐射时间为60、90、120、150和180 s;致死率统计优化后,最适辐射时间为150 s,致死率为90%~96%。（2）筛选方法：将ARTP诱变处理后的菌株点种在硝酸纤维滤膜上,30°C培养2 d,然后将长有菌落的滤膜小心取出并漂浮在4 mg/ml二氯靛酚（DCPIP）溶液（0.1 mmol/L磷酸缓冲液pH 7.0）,30°C培养1 d直到全部菌落染成蓝色。然后将该滤膜取出,漂浮在250 mmol/L AD溶液（2%甲醇和50 mmol/L Tris pH 7.0缓冲液）,室温放置15 min左右,观察菌落颜色变化。KSDD在底物 AD 存在时会脱氢产生雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）和H+,H+可以使被DCPIP染成蓝色的菌株褪色。因此,酶活缺陷型的菌株会仍保持蓝色,而酶活高的菌株会褪色为黄色（图3）。（3）对获得的潜在的高产AD菌株进行进一步的酶活检测以及产量验证,以期获得最优的突变株。
结论：获得了4株具有潜在的高产AD能力的菌株,其中,最优的突变株ZADF-4的KSDD酶活相较于出发菌株ZAD下降了81.2%（图4）,活性胶也证明其KSDD酶活相较于出发菌株下降明显（图5）。薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）实验证明突变株 ZADF-4中,AD的产量有了明显的提高（图6和图7）,提高到了(6.28±0.11) g/L, AD/ADD提高到8：1,AD的摩尔产率达到60.3%（表1）。对出发菌株ZAD和突变株ZADF-4的ksdd基因进行克隆和序列比对,发现ZADF-4的ksdd序列在5'端缺失9个核苷酸（atgttctac）,导致3个氨基酸（MFY）的缺失;还发生了两个点突变,其中一个是无义突变（g.15a>6t）,另一个是有义突变（g.413c>404t）,并引起了相应位置上的氨基酸变化（p.138S>135L）。上述的基因突变及其引起的氨基酸序列的变化可能是引起M. neoaurum ZADF-4中KSDD酶活降低及AD产量提高的主要原因。 相似文献
2.
采用紫外诱变方法对实验室保藏的粗酶活为10 U/mL的野生微球菌SX-1进行诱变处理以获得高产酶能力的菌株,实验得到最佳诱变条件为:15 W紫外灯,垂直照射距离为30 cm,处理时间为90 s,通过荧光圈初筛和摇瓶复筛,筛选出一株突变菌株,酶活可达到22.5 U/mL,比出发菌株脂肪酶活力提高了125%,将其连续传代5次,酶活稳定,是一株比较理想的脂肪酶产生菌. 相似文献
3.
通过N^＋离子束诱变斜卧青霉A10,经透明圈法初筛,摇瓶发酵复筛,测定酶活,获得一株高产纤维素酶的突变菌株LA17,酶活达5．48IU／ml．与出发株相比,其产酶能力提高44．20％． 相似文献
4.
Chao LIU Xian ZHANG Zhi-ming RAO Ming-long SHAO Le-le ZHANG Dan WU Zheng-hong XU Hui LI 《Journal of Zhejiang University. Science. B》2015,(4):286-295
目的:获得一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)的Mycobacterium neoaurum突变株。创新点:获得了一株3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KSDD)酶活缺陷型的高产AD的诱变菌株Mycobacterium neoaurum ZADF-4,并采用菌落显色法筛选KSDD酶活缺陷型M.neoaurum突变株。方法:(1)诱变方法:采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术来处理出发菌株M.neoaurum ZAD。ARTP诱变条件如下:功率40 W,气流量12.5 L/min,辐射距离1 cm,样品体积10μl,辐射时间为60、90、120、150和180 s;致死率统计优化后,最适辐射时间为150 s,致死率为90%~96%。(2)筛选方法:将ARTP诱变处理后的菌株点种在硝酸纤维滤膜上,30°C培养2 d,然后将长有菌落的滤膜小心取出并漂浮在4 mg/ml二氯靛酚(DCPIP)溶液(0.1 mmol/L磷酸缓冲液p H 7.0),30°C培养1 d直到全部菌落染成蓝色。然后将该滤膜取出,漂浮在250 mmol/L AD溶液(2%甲醇和50 mmol/L Tris p H 7.0缓冲液),室温放置15 min左右,观察菌落颜色变化。KSDD在底物AD存在时会脱氢产生雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)和H+,H+可以使被DCPIP染成蓝色的菌株褪色。因此,酶活缺陷型的菌株会仍保持蓝色,而酶活高的菌株会褪色为黄色(图3)。(3)对获得的潜在的高产AD菌株进行进一步的酶活检测以及产量验证,以期获得最优的突变株。结论:获得了4株具有潜在的高产AD能力的菌株,其中,最优的突变株ZADF-4的KSDD酶活相较于出发菌株ZAD下降了81.2%(图4),活性胶也证明其KSDD酶活相较于出发菌株下降明显(图5)。薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)实验证明突变株ZADF-4中,AD的产量有了明显的提高(图6和图7),提高到了(6.28±0.11)g/L,AD/ADD提高到8:1,AD的摩尔产率达到60.3%(表1)。对出发菌株ZAD和突变株ZADF-4的ksdd基因进行克隆和序列比对,发现ZADF-4的ksdd序列在5’端缺失9个核苷酸(atgttctac),导致3个氨基酸(MFY)的缺失;还发生了两个点突变,其中一个是无义突变(g.15a>6t),另一个是有义突变(g.413c>404t),并引起了相应位置上的氨基酸变化(p.138S>135L)。上述的基因突变及其引起的氨基酸序列的变化可能是引起M.neoaurum ZADF-4中KSDD酶活降低及AD产量提高的主要原因。 相似文献
5.
目的：研究纤维素分解菌的分离及产酶条件优化.方法：以含菌秸秆、腐木叶和玉米地土壤为原料,经富集、初筛培养后,根据水解圈直径/培养天数进行纤维素分解菌的复筛培养,测定CMC酶活和FPA滤纸酶活,并进行了产酶条件的单因素优化实验.结果：采集的样品中共分离到4个菌株,均为细菌,其中H-3的羧甲基纤维素（CMC）酶活和滤纸（FPA）酶活最高,分别是0.5401U.m l-1、0.2923U.m l-1.结论：H-3菌分解纤维素的能力最强,最佳产酶条件为温度30℃,pH4.5.不含尿素,葡萄糖和纤维素含量为0.4%和0.6%. 相似文献
6.
利用木聚糖作为唯一碳源的基础盐培养,在50℃培养条件下,从新乡周围土样及腐殖质中筛选到1株产耐热β-木聚糖酶细菌,初步鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium FLH-2）.该菌株在40~55℃生长良好,最适生长温度50℃.木聚糖酶粗酶性质研究表明：该酶最适pH和最适温度分别为6.0和65℃;在pH 5.0~9.0及温度30~75℃之间酶活相对稳定,分别处理30 min,相对酶活仍保持在80%以上. 相似文献
7.
本研究以被孢霉菌株（Mortierella alpina）为出发菌株,分别采用紫外线诱变、亚硝酸钠诱变及紫外线与亚硝酸钠的复合诱变方式对孢子悬浮液进行诱变处理.结果表明,在紫外线处理6min后,酶活性高达8.657U/mL,比出发菌株提高2.354倍;在亚硝酸钠处理8min后,酶活性为6.081U/mL,较之出发菌株提高1.658倍;在复合诱变的紫外照射6min和亚硝酸钠处理8min的情况下,酶活性高达9.141U/mL,比出发菌株提高了2.493倍. 相似文献
8.
9.
李俊刚 《绵阳师范学院学报》1994,(Z1)
本研究对生淀粉糖化菌黑曲霉S一1原生质体制备与再生因素进行了探讨.该菌菌丝体酶解2小时以后,可制得2×10~8/ml原生质体,其再生率达13.3%.采用波长λ_1=260nm、λ_2=266nm,能量8mj的激光直接照射该菌原生质体.结果表明:激光对原生质体的致死率比对孢子的致死率高;激光对原生质体的诱变效应也较好,其正变率比孢子的正突变率高34%;与出发菌株相比生淀粉糖化酶活性平均提高37.4%,最高突变株酶活提高91%. 相似文献
10.
紫外线复合Nd:YAG激光对Bacillus sp.产脂肪酶的诱变 总被引：3，自引：0，他引：3
以Bacillus sp．为出发菌株，经过紫外线诱变，筛选出较稳定的菌株UV-4，其产脂肪酶活力较出发菌株提高了28％；UV-4经过YAG激光诱变处理，得到变株Y-1，其产酶能力在此基础上又提高了41％，且产酶水平较为稳定。 相似文献
11.
从土壤中分离筛选到一株降解生淀粉能力较强的菌株,通过固体发酵其生淀粉糖化酶活为2237U/g（按U/g麦麸计）,RDA值为15.25%。根据形态学特性初步鉴定该菌属于拟青霉属（Paecilomyces sp.）。其最适生长温度为30℃,最适生长起始pH5。其粗酶液24h水解生玉米淀粉的水解率为86.88%;对不同来源的生淀粉的水解能力不同,为玉米粉〉面粉〉米粉〉木薯粉〉甘薯淀粉;其最适作用pH为4,最适作用温度为70℃。 相似文献
12.
原生质体紫外诱变选育茶薪菇的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
研究了茶薪菇原生质体的形成及影响因素，并进行了以原生质体为材料的诱变育种工作．实验表明，培养5天的茶薪菇茵丝体酶解3小时原生质体数目达到最大值．原生质体经紫外线照射20秒，致死率即达70％以上．再生茵株经筛选后，原生质体再生株C16和诱变株C304产量较对照分别提高了42．7％和17．9％． 相似文献
13.
纯化了黑曲霉Aspergillus niger FJL0801糖化酶,并对其酶学性质进行研究.粗酶液经纯化后,较粗酶液纯化了38.42倍,酶活回收率达到17.45%.酶最适作用温度为60℃;最适反应pH值为4.5;在60℃下,保温2 h后,相对酶活42%±2.8%.在pH4.5,60℃下,作用时间在60 min以内,其酶活保存89%±2.56%;其酶学性质符合淀粉糖化工业化过程中对酶的要求,该酶比较适合应用于淀粉糖化工业. 相似文献
14.
Keratinase production and keratin degradation by a mutant strain of Bacillus subtilis 总被引：2，自引：0，他引：2
A new feather-degrading bacterium was isolated from a local feather waste site and identified as Bacillus subtilis based on morphological, physiochemical, and phylogenetic characteristics. Screening for mutants with elevated keratinolytic activity using N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine mutagenesis resulted in a mutant strain KD-N2 producing keratinolytic activity about 2.5 times that of the wild-type strain. The mutant strain produced inducible keratinase in different substrates of feathers, hair, wool and silk under submerged cultivation. Scanning electron microscopy studies showed the degradation of feathers, hair and silk by the keratinase. The optimal conditions for keratinase production include initial pH of 7.5, inoculum size of 2% (v/v), age of inoculum of 16 h, and cultivation at 23 ℃. The maximum keratinolytic activity of KD-N2 was achieved after 30 h. Essential amino acids like threonine, valine, methionine as well as ammonia were produced when feathers were used as substrates. Strain KD-N2,therefore, shows great promise of finding potential applications in keratin hydrolysis and keratinase production. 相似文献
15.
Liujia SHI Fangfang YANG Yanyan XU Shoufeng WANG 《Journal of Zhejiang University. Science. B》2021,22(3):204-213
Acetylcholinesterase(AChE) is a key enzyme used to detect organophosphorus pesticide residues by the enzyme inhibition method.An accidental discovery of a mutant strain with AChE activity was made in our laboratory during the process of AChE expression by Pichia pastoris.The pPIC9 K-Drosophila melanogaster acetylcholinesterase(DmAChE)-like expression vector was constructed by codon optimization of this mutant strain,which was transformed into P.pastoris GS115,and positive clones were selected on yeast peptone dextrose(YPD) plate with G418 at 4.0 mg/mL.The GS115-pPIC9 K-DmAChE-like strain was subjected to 0.5% methanol induction expression for 120 h,with a protein band at 4.3 kDa found by the tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) pattern of the fermentation supernatant.After preliminary purification by ammonium sulfate precipitation,the enzyme activity was detected to be 76.9 U/(mL·min).In addition,the pesticide sensitivity test proved that DmAChE-like is selective and sensitive to organophosphorus pesticides. 相似文献
16.
本实验采用乳糖发酵短杆菌B_(27-12)作为出发菌株进行试验,首先,通过噬菌体敏感性试验,证明B_(27-12)对天津短杆菌T_(6-13)的五种噬菌体不敏感,从而证明B_(27-12)与T_(6-13)是不同噬菌体类型的谷氨酸生产菌。然后,将B_(27-12)用诱变效率高的原生质体诱变方法进行诱变选育,得到产酸较高的突变株,再进一步通过硫酸二酯(DES)和紫外线复合诱变法进行诱变,选育得到一株产酸较高的突变株D_(16)。 相似文献
17.
原生质体融合技术选育纤维素发酵产油菌株 总被引：2，自引：0，他引：2
利用灭活原生质体进行融合的方法来选育能直接利用纤维素原料产油脂菌株。实验分别从双亲株原生质体灭活方式以及融合条件的选择进行了研究。 相似文献
18.
为了获得高产纤维素酶菌株,有效地开发和利用纤维素资源.本研究通过对野外采集的大型真菌进行分离纯化,获得了16个菌株.利用CMC固体培养、刚果红染色,测量水解圈与菌落直径的比值(H/C值),对获得的菌株进行初筛;通过液体发酵培养,测定其上清液中的滤纸酶活力(FPA),对菌株进行复筛,最终获得了纤维素酶活性较高的菌株01.以稻草和羧甲基纤维素为碳源,研究了培养温度、pH值、培养时间对真菌菌株01产纤维素酶的影响.结果表明,该菌株产纤维素酶的最适培养温度为27℃,pH值为5.0,培养时间为6 d,菌株01的滤纸酶活性达到580.0 IU/mL.因此,真菌01可作为纤维素酶研究和饲料加工等生产的备选菌株. 相似文献
19.
应用刚果红鉴定培养基,从土壤中筛选出两种分解纤维素能力较强的真菌,分别命名为NY01和NY02.滤纸条降解度分析显示,NY01的降解能力高于NY02.应用分子生物学手段,对两株菌rDNA的ITS区域序列分析显示,NY01与木霉的相似性高达99%,NY02与毛霉的相似性高达99%,暗示NY01可能是木霉的一个种,NY02可能是毛霉的一个种.培养基中碳氮比例对两株真菌纤维素降解酶活性的研究显示,在N/C比值较低和较高时,CMC酶和FPA酶活性都低,N/C比值在1∶8时酶活性最高,说明两株真菌降解纤维素的最佳N/C比值是1∶8. 相似文献