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1.
为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR) 从弓形虫RH 株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性. 相似文献
2.
为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与GenBank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性. 相似文献
3.
基于基因工程技术 ,用PCR法扩增出编码ICA6 9的cDNA片段 ,直接克隆到pSPORT 1质粒上 ,经DNA序列测定 ,插入到GST融合蛋白表达载体 pGEX 2T ,构成重组质粒 p2T ICA6 9,得到的表达产物GST ICA6 9融合蛋白用间接ELISA法检测其免疫原性 .测序结果表明 ,所获PCR产物已正确重组到PGEX 2T表达型质粒中 .重组质粒在原核细胞中表达的融合蛋白具有免疫原性 ,并能应用于Ⅰ型糖尿病病人血清中抗ICA6 9抗体的检测 .所获得的表达产物为重组ICA6 9融合抗原 ,有助于提高Ⅰ型糖尿病的预报率和确诊率 . 相似文献
4.
从水生植物凤眼莲叶片中提取总 RNA,经 RT-PCR扩增出Ca2＋-ATPase基因片段,经限制性内切酶(Sma I,Not I)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Ca2＋-ATPase基因融合表达载体,．转化菌经IPTG诱导表达,获得了大小约48 kD的可溶性目的蛋白,与预期相吻合．利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Gluta-thione Sepharose 4B)亲和介质对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白． 相似文献
5.
目的构建L-ficolin突变体的原核表达载体，为研究L-ficolin的糖结合位点奠定基础。方法设计L-ficolin突变体基因上、下游引物，分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。以插入L—ficolin M2（Val144Phe）和M6（Glu 307Asp）点突变的完整编码区基因的质粒pCDNA3-L-ficolin为模板，通过PCR扩增获得突变体的基因片段，将其克隆入原核表达载体pGEX—KG．然后通过酶切和序列测定对其进行鉴定；将此表达载体转化入表达菌BL21（DE3）pLvSs诱导表达。并采用SDS—PAGE对表达产物进行鉴定。结果经酶切及序列分析表明．成功地构建了重组原核表达载体pGEX-KG—L—ficolin—M2、pGEX-KG-L-ficolin—M6，SDS—PAGE显示目的蛋白大量表达。结论L—ficolin突变体融合蛋白可以在大肠杆菌中大量表达。为研究L-ficolin的糖结合位点打下基础。 相似文献
6.
《实验技术与管理》2014,(1)
目的:构建microRNA的表达载体,再转染生物体细胞观察该microRNA的转录或表达情况,以获知它的作用机理及对生物体的影响。方法:以microRNA-21(简化为miR-21)为例说明构建表达载体的方法。根据microRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共约470个碱基序列,设计PCR引物,PCR扩增,PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒双酶切后,用T4连接酶进行连接反应,并转化入感受态细胞,筛选后对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析,并将其转染Hela细胞,经RT-PCR实验检测其表达情况。结果:pcDNA3.1(+)/miR-21过表达载体转染细胞后使得miR-21在细胞中过表达。结论:成功构建了miR-21的真核表达载体,为进一步研究miR-21功能及作用机制奠定实验基础。 相似文献
7.
人酸性成纤维细胞生长因子cDNA的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
目的：研究人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）cDNA在不同表达系统中的表达，旨在得到高效表达haFGF的表达系统。方法：采用PCR方法扩增人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF）cDNA，将该cDNA片段分别插入表达载体pKK223-3及pET3C的表达框架中，筛选得到了重组质粒pKK223-3-haFGF及pET3C-haFGF，分别转化大肠杆菌JM109及BL21（DE3），构建了表达菌株JM109/pKK223-3-haFGF及BL21(DE3)/pET3C-haFGF,用IPTG诱导表达。结果；SDS-PAGE的结果表明，表达菌株BL21(DE3)/pET3C-haFGF能高效表达人酸性成纤维细胞生长因子，而JM109/pKK223-3-haFGF诱导后目标蛋白带不明显。结论：BL21（DE3）/pET3C表达系统更适于表达人酸性成纤维细胞生长因子。 相似文献
8.
克隆、构建弹状胭脂鱼弹状病毒糖蛋白基因重组质粒,并进行表达和鉴定.用RT-PCR方法扩增出大小为1.5kb的CSRV-G基因片断,构建重组克隆质粒pRSET-C/CSRV-G,并将其转化进入大肠杆菌DH5α原核表达系统,酶切鉴定证明重组质粒的正确性.经IPTG诱导后表达重组蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行分析鉴定,诱导后能够表达预期的分子量为55 kD的融合蛋白. 相似文献
9.
将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同的诱导时机、诱导温度、IPTG的浓度和Mg~(2+)浓度条件下培养大肠杆菌,通过SDS-PAGE和发光强度检测分析TAT-LUC的酶活性强度及表达量;将高活性的TAT-LUC与LUC对比检测ATP,通过发光强度分析TAT-LUC的敏感性和可靠性。表明:在含Mg~(2+)浓度为50mmol/L的LB培养基中将大肠杆菌培养至OD600为0.6时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,22℃诱导16h可获得大量高活性的TAT-LUC;相比LUC,TAT-LUC可以检测到小于10nmol/L的ATP,发光强度与ATP含量呈强相关性(R2=0.99);并且不用裂解细胞,TAT-LUC可直接检测至少40个细胞内ATP;穿膜肽标记的荧光素酶蛋白成功用于检测活细胞内的ATP含量。 相似文献
10.
通过PCR技术扩增出人铁蛋白基因,经酶切后与表达载体质粒pGEX-4T-2连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌,利用菌落PCR、质粒双酶切、测序,证实成功地构建了人铁蛋白基因表达载体,利用IPTG对重组菌进行诱导表达,通过尿素洗涤纯化目的蛋白用于制备抗体． 相似文献
11.
从假单胞菌（Pseudomonassp．）XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌（Escherichiacoli）中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础．以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框（0RF）克隆至融合表达载体pET30a（＋）进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析．实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E．coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20％;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92％以上．表达蛋白具有良好活性． 相似文献
12.
将斑节对虾酚氧化酶原（prophenoloxidase,proPO）基因克隆进pET28a（＋）,在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析均能检测到一条分子量为79．4kDa的特异性条带,与推导的融合蛋白理论分子量82．4kDa基本相符;包涵体变性后对经Ni—NTAagarose纯化的变性液进行复性,表现出0．3851U／mg．min的PO活性;不同条件下的诱导表达结果显示,18℃时诱导培养能检测到目的蛋白的可溶性表达,经诱导9h后可溶性表达比例达到最高,约占菌体可溶性蛋白总量的s．56％;可溶性表达的目的蛋白纯化后经胰酶消化,可检测到分子量为60kDa、42．7kDa的特异性条带,并表现出0．4249U／mg．min的PO活性． 相似文献
13.
《天津大学学报(英文版)》2015,(1)
The Bacillus strain BH072 isolated from a honey sample showed strong antifungal activity against phytopathogen. Gene cloning test demonstrated that the strain had a tas A gene encoding an antifungal Tas A protein. Although the wild strain simultaneously produced various antifungal substances, only the physicochemical property and antifungal activity of Tas A protein were unclear due to the difficulty in extraction. In this study, tas A gene encoding the protein from Bacillus sp. BH072 was amplified by using the polymerase chain reaction(PCR) method and cloned into p ET 28a(+) vector, and then expressed in host cells Escherichia coli BL21(DE3). The expressed proteins were collected by centrifugation and ultrasonic treatment, and then purified by using nickel-nitrilotriacetic acid(Ni-NTA)metal affinity column and dialysis methods. The result of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) test showed that an expected protein band appeared with a size of 31 k Da. The expressed products possessed antifungal activity against the phytopathogenic indicator strain Botrytis cinerea. A genetically engineered strain tas A of E. coli was established in this study which can efficiently express Tas A protein. 相似文献
14.
根据GenBank数据库中猪圆环病毒Ⅱ型的基因组序列设计引物,采用PCR技术从病料基因组DNA中扩增出PCVⅡ河南地方株ORF4基因,全长180 bp,编码59个氨基酸.将该基因克隆至载体pGEX-4T-3中形成pGEX-4T-3-ORF4表达载体.经PCR、酶切和测序鉴定后,转化表达菌株BL21（DE3）诱导表达.SDS-PAGE结果显示：ORF4能够在大肠杆菌中表达,产物的分子量约为32 kD,且以包涵体形式存在.Western Blot检测结果显示,纯化后的ORF4蛋白能够与鼠抗6＆#215;His标签单克隆抗体发生特异性反应,为进一步研究PCVⅡORF4蛋白的特性与功能奠定了基础. 相似文献
15.
将人细胞周期蛋白D1基因克隆入原核表达载体pET-20b中获得重组质粒pET-20b-eyeD,经酶切鉴定正确后转化大肠杆菌BL21PlaysS后获得表达菌株．该菌株经IPTG诱导后表达的目的蛋白有部分分泌到培养基上清中,将培养基上清中的蛋白沉淀后用Ni^2＋螯合柱进行纯化,最后可得到纯度达到95％以上的目的蛋白．蛋白电泳显示纯化蛋白的分子量约为33KD,Westemblot分析表明,在电泳胶的相应分子量处出现特异性条带,说明已经成功表达和纯化了重组人细胞周期蛋白D1． 相似文献
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孙晓东 《陕西教育学院学报》2010,26(2):106-107,121
为了构建人C6orf210基因原核表达载体,并在E．coliBL21中表达并纯化。采用RT—PCR扩增人C6orf210基因片段,并将其克隆到原核表达载体Pet21a中,构建重组质粒pET21a—C6ort210。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E．coliBL21,经IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示获得全长为1188bp的人的CAiorf210基因片段。以构建的重组质粒pET21a—C6orf210转化E．coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约66000的融合蛋白。经SINS—PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为C6orf210。 相似文献
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研究用亲和融合谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)的方法纯化重组人白细胞介素 6(IL 6)的发酵和纯化工艺 ,使用含有质粒pHZl818的E .coliJMl0 9在 2XYT培养基中进行发酵表达 ,IL 6表达为与谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合的融合蛋白GST IL 6.融合蛋白存在可溶的活性蛋白和不可溶的包含体两种形式 ,此包含体无活性且无法复性 ,无法用亲和层析回收 ,通过实验优化摇床发酵的诱导温度和转速 ,以增加可溶融合蛋白的表达 .菌体超声破碎液后 ,上清液用作亲和柱层析 ,可将融合蛋白提纯至 80 00 ,每升发酵液可得 10mg融合蛋白 ,用凝血酶裂解处理 6h ,亲和标志物GST被特异性切除 ,裂解得到的IL 6用离子交换柱层析可纯化至 95 00 ,MTT法测得纯化的IL 6生物学活性为 1.0 2× 10 8IU/mg . 相似文献
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Zhong-hui ZHANG Li-juan DU Di XIANG Shun-ying ZHU Ming-yuan WU Hui-li LU Yan YU Wei HAN 《Journal of Zhejiang University. Science. B》2009,10(2)
Midkine is a heparin-binding growth factor,which plays important roles in the regulation of cell growth and differentiation.The non-tagged recombinant human midkine (rhMK) is therefore required to facilitate its functional studies of this important growth factor.In the present work,rhMK was expressed in Escherichia coli (E.coli) BL21 (DE3).The expression of midkine was efficiently induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG).After sonication,midkine was recovered in an insoluble form,and was dissolved in guaoidine hydrochloride buffer.Renaturation of the denatured protein was carried out in the defined protein refolding buffer,and the refolded protein was purified using S-Sepharose ion-exchange chromatography.The final preparation of the rhMK was greater than 98% pure as measured by sodium dodecylsulfate-polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) and reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC).The purified rhMK enhanced the proliferation of NIH3T3 cells. 相似文献
20.
Two heterologous expression systems using thioredoxin (trxA) as a gene fusion part in Escherichia coli were developed to produce recombinant pediocin PA-1. Pediocin PA-1 structural gene pedA was isolated from Pediococcus acidilactici PA003 by the method of polymerase chain reaction (PCR), then cloned into vector pET32a(+), and expressed as thioredoxin-PedA
fusion protein in the host strain E. coli BL21 (DE3). The fusion protein was in the form of inclusion body and was refolded before purification by nickel-iminodiacetic
acid (Ni-IDA) agarose resin column. Biological activity of recombinant pediocin PA-1 was analyzed after cleavage of the fusion
protein by enterokinase. Agar diffusion test revealed that 512-arbitrary unit (AU) recombinant pediocin PA-1 was obtained
from 1 ml culture medium of E. coli (pPA003PED1) using Listeria monocytogenes as the indicator strain. Thioredoxin-PedA fusion gene was further cloned into pET20b(+). Thioredoxin-PedA fusion protein
was detected in both the periplasmic and cytoplasmic spaces. The recombinant pediocin PA-1 from the soluble fraction attained
384 AU from 1 ml culture medium of E. coli (pPA003PED2). Therefore, biologically active pediocin PA-1 could be obtained by these two hybrid gene expression methods. 相似文献