共查询到20条相似文献，搜索用时 93 毫秒
1.
以pErl30a为载体构建的表达拟南芥热激因子AtHsfAla的大肠杆菌EcoliM15（pET30a／His6一AtHsfAla）为实验材料,以IPTG诱导6XHis融合蛋白的表达并经过Ni2＋柱分离纯化AtHsfAla,再通过SDS—PAGE鉴定表达蛋白和纯化蛋白．结果显示,AtHsfAla蛋白在在PET原核表达系统中能够有效表达,并能通过亲和层析获得纯化的AtHsfAla蛋白．研究结果为揭示拟南芥热激因子AtHsfAla的作用机理奠定基础． 相似文献
2.
孙晓东 《陕西教育学院学报》2010,26(2):106-107,121
为了构建人C6orf210基因原核表达载体,并在E．coliBL21中表达并纯化。采用RT—PCR扩增人C6orf210基因片段,并将其克隆到原核表达载体Pet21a中,构建重组质粒pET21a—C6ort210。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E．coliBL21,经IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示获得全长为1188bp的人的CAiorf210基因片段。以构建的重组质粒pET21a—C6orf210转化E．coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约66000的融合蛋白。经SINS—PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为C6orf210。 相似文献
3.
4.
人酸性成纤维细胞生长因子cDNA的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
目的：研究人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）cDNA在不同表达系统中的表达，旨在得到高效表达haFGF的表达系统。方法：采用PCR方法扩增人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF）cDNA，将该cDNA片段分别插入表达载体pKK223-3及pET3C的表达框架中，筛选得到了重组质粒pKK223-3-haFGF及pET3C-haFGF，分别转化大肠杆菌JM109及BL21（DE3），构建了表达菌株JM109/pKK223-3-haFGF及BL21(DE3)/pET3C-haFGF,用IPTG诱导表达。结果；SDS-PAGE的结果表明，表达菌株BL21(DE3)/pET3C-haFGF能高效表达人酸性成纤维细胞生长因子，而JM109/pKK223-3-haFGF诱导后目标蛋白带不明显。结论：BL21（DE3）/pET3C表达系统更适于表达人酸性成纤维细胞生长因子。 相似文献
5.
根据Imbereehts等报道的EHEC F18菌毛主要亚单位(fedA)基因序列设计一对引物，以重庆地区仔猪水肿病流行强毒株W96基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增到约500bp的核酸片段。用常规DNA重组技术将该片段克隆到表达载体pET28b( )的SalI-Hindm位点之间构建重组表达质粒pET28fedA，序列测定结果显示该克隆片段长447bp，同源性分析表明该基因片段与GenBank报道的fedA核苷酸序列有99．4％的同源性，W96株fedA基因三处核苷酸发生变异，其中两个为无义突变，另一个导致Q100R突变。将pET28fedA转入BL21(DE3)中进行诱导表达，经SDS—PAGE电泳检测上清存在约20KD的蛋白，6xHis affinity tag IMAC亲和层析显示该蛋白能被亲和纯化，说明是含有组氨酸标签的融合目的蛋白。 相似文献
6.
将人细胞周期蛋白D1基因克隆入原核表达载体pET-20b中获得重组质粒pET-20b-eyeD,经酶切鉴定正确后转化大肠杆菌BL21PlaysS后获得表达菌株．该菌株经IPTG诱导后表达的目的蛋白有部分分泌到培养基上清中,将培养基上清中的蛋白沉淀后用Ni^2＋螯合柱进行纯化,最后可得到纯度达到95％以上的目的蛋白．蛋白电泳显示纯化蛋白的分子量约为33KD,Westemblot分析表明,在电泳胶的相应分子量处出现特异性条带,说明已经成功表达和纯化了重组人细胞周期蛋白D1． 相似文献
7.
从假单胞菌（Pseudomonassp．）XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌（Escherichiacoli）中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础．以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框（0RF）克隆至融合表达载体pET30a（＋）进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析．实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E．coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20％;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92％以上．表达蛋白具有良好活性． 相似文献
8.
0 前言 人的PAI—2是一种通过抑制纤溶酶原激活物来调节纤溶酶原激活过程的特异抑制网子。生化性质研究和临床应用需要大量的PAI—2蛋白,但通过纯化大规模培养的细胞上清和胎盘抽提液而获取PAI—2是很困难的。在大肠杆菌和哺乳运动细胞中也尚未获得高效表达。我们考虑到用昆虫杆状病毒表达载体系统(Bacul—ovir us expression vector system:BEVS)进行表达。 BEVS是一种比较新的载体宿主表达系统,它与细菌、酵母及哺乳动物细胞表达系统相比具有以下几个方面的优点:1)允许插入的外源基因容量较大;2)能高效表达。重组蛋白达到1～500mg/L;3)应用范围广泛。可以表达各种胞内、分泌和膜蛋白。如用的是多角体蛋白启动于为晚期启动子,可表达一些具有细胞毒作用的蛋白;4)通过双启动于载体或两种不同重组病毒共同感染细胞,可获得多种蛋白的同时表达;5)重组病毒可通过穿刺感染或与野生病毒共包装,形成具有多角体外壳的重组病毒口服感染幼虫,从而在虫体中表达。表达量常比胞内高10～100倍;6)安全。杆状病毒具有严格的宿主专一性,不感染脊椎动物或植物;7)表达蛋白与天然蛋白相似。可以进行高等真核细胞内的蛋白修饰,剪接及运输。 BEVS中作为基因表达载体的病毒是苜蓿尺蠖核型多角体病毒(ACNPV)和家蚕核型多角 相似文献
9.
通过PCR扩增高致病性禽流感H5N1的HA和HA1基因片段,利用原核表达系统表达重组HA和HA1蛋白,并用SDS-PAGE,Western-blotting和血凝试验进行重组HA蛋白的鉴定和血凝活性鉴定.结果表明,经过HA蛋白胞外段分析、重组载体的酶切鉴定得出的重组HA蛋白,在血凝试验中能与HA特异性抗体结合,并有较高的血凝活性.利用表达载体pET42a表达AIV-H5亚型的HA基因,为进一步利用重组蛋白研制AIV-H5抗体的ELISA检测方法,研制抗AIV-H5亚型的单克隆抗体提供基础. 相似文献
10.
《赣南师范学院学报》2021,(6):74-77
柑橘黄龙病菌CpaB基因编码一种菌毛组装蛋白(Flp pilus assemble protein),前期研究已经证实该蛋白具有外分泌性.在本研究中,首先构建pET30a-CpaB重组载体,然后将其转化BL21(DE3)感受态细胞,重组菌在37℃,0.2 mmol·L(-1) IPTG诱导下,CpaB蛋白可被成功诱导表达,经过Ni-NTA亲和柱纯化后,获得纯度较高的CpaB重组蛋白,分子量为28.2 kDa,以其为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗血清;采用Western blot对多抗血清的特异性进行分析,结果显示该多抗能特异性结合纯化的CpaB蛋白;进一步使用制备好的CpaB抗血清对感染黄龙病和健康的柑橘样品进行DTBIA检测,具有较好的区分度.这些研究结果为柑橘黄龙病快速检测体系的建立提供理论参考. 相似文献
11.
目的构建L-ficolin突变体的原核表达载体，为研究L-ficolin的糖结合位点奠定基础。方法设计L-ficolin突变体基因上、下游引物，分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。以插入L—ficolin M2（Val144Phe）和M6（Glu 307Asp）点突变的完整编码区基因的质粒pCDNA3-L-ficolin为模板，通过PCR扩增获得突变体的基因片段，将其克隆入原核表达载体pGEX—KG．然后通过酶切和序列测定对其进行鉴定；将此表达载体转化入表达菌BL21（DE3）pLvSs诱导表达。并采用SDS—PAGE对表达产物进行鉴定。结果经酶切及序列分析表明．成功地构建了重组原核表达载体pGEX-KG—L—ficolin—M2、pGEX-KG-L-ficolin—M6，SDS—PAGE显示目的蛋白大量表达。结论L—ficolin突变体融合蛋白可以在大肠杆菌中大量表达。为研究L-ficolin的糖结合位点打下基础。 相似文献
12.
BpHi008A是一种水稻诱导性防卫基因，以单拷贝序列存在，当秧苗受到褐飞虱咬食或机械损伤后，该基因便大量表达，编码一个含82个氨基酸的蛋白质．将此基因重组到表达型载体pET28a后，转化入能产生T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株中，以10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离并鉴定未经IPTG诱导和经IPTG诱导后不同时刻的表达产物．结果表明利用T7RNA聚合酶／启动子表达系统可使蛋白质在大肠杆菌中高水平表达，并且表达产物的分子量约为9．6KDa．本实验表达的蛋白质可用为抗原刺激抗体的产生，为免疫定位和Western杂交做准备． 相似文献
13.
本文将已构建好的带有乳糖酶基因的杆状病毒(AcNPV p10 Z-9)作为载体,经口服感染人工饲养的银纹夜蛾(Argyrogra(?) agnata)幼虫,在昆虫体内高效表达乳糖酶蛋白,表达水平可占虫体可溶性蛋白的20％。将虫匀浆后,经高速离心、丙酮沉淀及冷冻干燥等方法,即可制备成粗酶。进一步经FPLC β-aminophenyl-β-D-thiogalactopyranoside亲和柱层析方法制备成精制酶,可作为试剂及药物应用.经测定纯化后的酶比活为150000u/mg蛋白。酶活力的最适pH值是6.0～8.0,最适温度为30～40℃。该酶水解对硝基苯-β-D-半乳糖(ONPG)的米氏常数(Km)值为7.14×10~(4)mol/L,乳糖可竞争性地抑制乳糖酶水解ONPG的能力,Ki值为1.30×10~(-3)mol/L。 相似文献
14.
将斑节对虾酚氧化酶原（prophenoloxidase,proPO）基因克隆进pET28a（＋）,在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析均能检测到一条分子量为79．4kDa的特异性条带,与推导的融合蛋白理论分子量82．4kDa基本相符;包涵体变性后对经Ni—NTAagarose纯化的变性液进行复性,表现出0．3851U／mg．min的PO活性;不同条件下的诱导表达结果显示,18℃时诱导培养能检测到目的蛋白的可溶性表达,经诱导9h后可溶性表达比例达到最高,约占菌体可溶性蛋白总量的s．56％;可溶性表达的目的蛋白纯化后经胰酶消化,可检测到分子量为60kDa、42．7kDa的特异性条带,并表现出0．4249U／mg．min的PO活性． 相似文献
15.
水稻多顺反子质体表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据发表的水稻叶绿体基因组序列，对比烟草高频同源重组目标区(NCBI编号：X15901)设计引物，用PCR的方法克隆到一段3．939kb叶绿体DNA片段，命名为crDNA．以其作为外源基因定点整合的同源重组片段，以来自烟草叶绿体的强启动子Prm、甘露聚糖酶man、绿荧光蛋白gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA和终止子psbA3’，构建水稻质体多顺反子表达载体pLM3(-psbCPrm—SD-man—SD-gfp-SD-aa-dA—psbA3’-tmm-)．并在大肠杆菌中通过平板定性对所构建载体上的表达盒进行了功能鉴定，结果表明：在大肠杆菌中，多顺反子盒式表达结构中的三个基因(man，gfp，aadA)均得到了表达． 相似文献
16.
绿色荧光蛋白基因在转基因金鱼中的整合与表达 总被引：2，自引：0，他引：2
通过分子克隆技术将鲤鱼β-肌动蛋白启动子(carpβ—actin promoter A)与编码绿色荧光蛋白(GFP)的cD-NA融合构建成能在真核生物体内表达的质粒载体pAGFP。质粒pAGFP经Pvu线性化后采用显微注射法导入金鱼受精卵，在胚胎发育初期，经紫外光激发能观察到少数胚胎发绿色荧光。在通过PCR实验检测出的5个阳性个体染色体DNA中，经点杂交实验证实有2个个体染色体基因组上整合了GFP基因。 相似文献
17.
苦瓜作为药食同源的植物,含有许多活性成分,其中核糖体失活蛋白MAP30是近年来研究较多的一种.根据G enbank中MAP30序列,采用PCR技术,从苦瓜基因组DNA中扩增出该基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-28a上,构建重组质粒pET-MAP30,经克隆载体转化菌液PCR鉴定,结果显示成功构建MAP30的原核表达载体. 相似文献
18.
目的获得重组TsARG2基因蛋白,为进一步研究其功能和制备特异抗体奠定基础.方法根据已报道的TsARG2基因序列,采用RT-PCR的方法获得TsARG2基因.将所得的PCR产物插入原核表达载体pQE30中,得重组质粒(pQE/TSARG2)并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱导表达出带有六个组氨酸的融合蛋白,采用镍固定金属亲和层析法纯化.结果序列分析表明TSARG2基因成熟肽编码区含有918bp,编码305个氨基酸;与GenBank(AY040204)中已报道的TSARG2分离物的核苷酸序列有100%同源性.经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的66%,分子质量约为35kDa.经Ni2 -NTAagarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带.结论在大肠杆菌中获得了TsARG2基因蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础. 相似文献
19.
从水生植物凤眼莲叶片中提取总 RNA,经 RT-PCR扩增出Ca2＋-ATPase基因片段,经限制性内切酶(Sma I,Not I)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Ca2＋-ATPase基因融合表达载体,．转化菌经IPTG诱导表达,获得了大小约48 kD的可溶性目的蛋白,与预期相吻合．利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Gluta-thione Sepharose 4B)亲和介质对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白． 相似文献
20.
《怀化学院学报》2015,(11)
通过搜索NCBI数据库,获得了与具有昆虫毒性的少棘蜈蚣毒素κ-SLPTX-Ssm2a高度同源的毒素分子κ-SLPTX-Ssm2b.通过密码子优化并全基因合成获得了其DNA序列,利用RF-cloning技术将κ-SLPTXSsm2b插入到表达载体pet-HIS-SUMO,通过自动诱导表达技术在大肠杆菌BL21(DE3)诱导融合蛋白表达,通过镍柱纯化并用Ulp1激酶切割sumo标签并释放毒素分子,通过MALDI-TOF质谱鉴定其分子量为3 390.4658Da.研究结果表明获得了与理论分子量(3391.04Da)一致的κ-SLPTX-Ssm2b目的毒素分子,其表达产量为2.1mg/L,为进一步研究该候选杀虫肽分子的生理活性奠定了基础. 相似文献