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1.
饱和苯酚氯仿法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR法扩增编码β-淀粉样蛋白的目的基因,利用基因克隆技术构建以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体pcDNA3.1-Aβ42×2,应用酶切及测序鉴定表达载体.相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段(为269bp),测序未发现突变,表达载体构建成功. 相似文献
2.
目的构建L-ficolin突变体的原核表达载体，为研究L-ficolin的糖结合位点奠定基础。方法设计L-ficolin突变体基因上、下游引物，分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。以插入L—ficolin M2（Val144Phe）和M6（Glu 307Asp）点突变的完整编码区基因的质粒pCDNA3-L-ficolin为模板，通过PCR扩增获得突变体的基因片段，将其克隆入原核表达载体pGEX—KG．然后通过酶切和序列测定对其进行鉴定；将此表达载体转化入表达菌BL21（DE3）pLvSs诱导表达。并采用SDS—PAGE对表达产物进行鉴定。结果经酶切及序列分析表明．成功地构建了重组原核表达载体pGEX-KG—L—ficolin—M2、pGEX-KG-L-ficolin—M6，SDS—PAGE显示目的蛋白大量表达。结论L—ficolin突变体融合蛋白可以在大肠杆菌中大量表达。为研究L-ficolin的糖结合位点打下基础。 相似文献
3.
从人直肠癌细胞株Colo320中提取总RNA,经RT-PCR扩增出SOD基因片段,经限制性内切酶（BamHI,Sinai）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了人SOD基因融合表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约44kD相吻合的融合蛋白带,获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepha—rose4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白． 相似文献
4.
从水生植物凤眼莲叶片中提取总 RNA,经 RT-PCR扩增出Ca2＋-ATPase基因片段,经限制性内切酶(Sma I,Not I)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Ca2＋-ATPase基因融合表达载体,．转化菌经IPTG诱导表达,获得了大小约48 kD的可溶性目的蛋白,与预期相吻合．利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Gluta-thione Sepharose 4B)亲和介质对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白． 相似文献
5.
以pLF3为模板,PCR扩增得到葡聚糖酶的启动子,并将启动子基因重新连接到切除启动子基因及葡聚糖酶基因的pLF3载体上,构建pLF3-pro载体.采用PCR的方法扩增朱黄青霉总DNA中的α-1-6-葡聚糖酶基因,并插入到pLF3-pro载体上,构建pLF3-Pro-Dex质粒,以大肠杆菌DH5α为宿主菌,酶切验证及PCR验证均表明成功构建了pLF3-Pro-Dex质粒,且重组质粒中的α-1-6-葡聚糖酶基因与朱黄青霉中的α-1-6-葡聚糖酶基因有93%的同源性. 相似文献
6.
以凡纳滨对虾为研究对象,通过RT-PCR技术扩增出铁蛋白（Ferritin）基因,经特定的酶切（Notl,Smal）后插入到表达质粒pGEX-4T-2上构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌．经菌落PCR和质粒双酶切鉴定确认,证实成功地构建了对虾铁蛋白基因的原核表达载体．再对重组菌用IPTG诱导表达,采用Glutathione Sepharose4B亲和层析得到目的蛋白用于制备抗体,为研究铁蛋白在对虾抗病毒免疫中的作用奠定基础． 相似文献
7.
将质粒pcDNA3．1-VEGF双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,并用酶切及测序等手段进行鉴定．而后利用脂质体转染包装细胞pA317,并检测病毒滴度．结果表明：成功构建了VEGF基因的重组逆转录病毒表达载体． 相似文献
8.
通过PCR技术扩增出人铁蛋白基因,经酶切后与表达载体质粒pGEX-4T-2连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌,利用菌落PCR、质粒双酶切、测序,证实成功地构建了人铁蛋白基因表达载体,利用IPTG对重组菌进行诱导表达,通过尿素洗涤纯化目的蛋白用于制备抗体． 相似文献
9.
以对虾白斑病毒DNA为模板扩增出Vp28基因,经限制性内切酶（SmaI,Not I）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Vp28基因原核表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约52kD相吻合的融合蛋白带,18℃诱导24h后获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白． 相似文献
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孙晓东 《陕西教育学院学报》2010,26(2):106-107,121
为了构建人C6orf210基因原核表达载体,并在E．coliBL21中表达并纯化。采用RT—PCR扩增人C6orf210基因片段,并将其克隆到原核表达载体Pet21a中,构建重组质粒pET21a—C6ort210。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E．coliBL21,经IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示获得全长为1188bp的人的CAiorf210基因片段。以构建的重组质粒pET21a—C6orf210转化E．coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约66000的融合蛋白。经SINS—PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为C6orf210。 相似文献
12.
以质粒pSC101为载体,用鸟枪法将短小芽孢杆菌A3染色体的β—内酰胺酶基因,克隆至大肠杆菌HB101。经质粒检测及酶切电泳分析证明,克隆的β—内酰胺酶基因位于2.6kb的EcoRI片段上,将此片段连接到质粒PAL32转化枯草杆菌,亦能表达并向胞外分泌β—内酰胺酶。 相似文献
13.
本论文用质粒载体PBC1-CD152转化大肠杆菌DH5a，以Amp(50mg／m1)筛选阳性单个菌落，LB培养基大量培养，按照质粒小量提取试剂盒使用方法抽提质粒，AVAⅠ、HindⅢ酶切和PCR扩增检测。可育雌鼠注射PMSG与HCG超排卵，输卵管内收集，移植受体母鼠输卵管腹壶部。结果表明：AVAⅠ酶切产物有一条为2．0kb的片段，证明是目的基因的启动子，从而证明质粒上含有我们所需的目的基因片段。HindⅢ酶切后出现一条带，与质粒的大小相符。共处理十批小鼠100只，有70只为可用供体，处理有效率为。70％，共捡胚1425枚，只均捡卵20．36枚。共处理受体小鼠十批40只，每只植入胚胎20枚，共出生小鼠274只，出生率为34．25％。本次实验成功扩增了免疫耐受诱导基因皮肤靶向表达载体PBC1-CD152，并以小鼠为动物模型，建立了完善的显微注射法转基因技术流程。 相似文献
14.
李弘华 《孝感职业技术学院学报》2003,6(3):71-73
利用设计合成的特异性引物，通过PCR扩增获得乙肝病毒的S区621个bpDNA片段．该扩增产物经EcoRI与BamHI双酶切后直接克隆进入PSK载体进行表达，再通过扩增重组菌株，以获得大量的S区DNA片段，对它们进行光敏生物素标记，制成探针，对乙肝病毒进行检测灵敏度高，特异性强，其灵敏度可达到4pg水平。 相似文献
15.
大豆β-1,3-葡聚糖酶基因转化烟草及抗病性的研究 总被引：6，自引：0，他引：6
构建了大豆β－１，３－葡聚糖酶（β－１，３－ｇｌｕｃａｎａｓｅ）基因的植物表达载体ｐＢＩ１２１－ｇｌｕ，并通过直接转化方法将其导入根癌农杆菌（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４受体菌中，构建了用于植物遗传转化的工程菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＢＩ１２１－ｇｌｕ），并以烟草为转化对象进行了遗传转儿，获得了大量再生的转基因烟草．ＰＣＲ，ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｍ以及Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交检测结果表明目的基因已整合到烟草基因组中．转基因植株苗期抗立枯病实验表明，部分转化β－１，３－葡聚糖酶基因的工程烟草对立枯丝核菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ．）表明出不同程度的抗性提高． 相似文献
16.
《实验技术与管理》2014,(1)
目的:构建microRNA的表达载体,再转染生物体细胞观察该microRNA的转录或表达情况,以获知它的作用机理及对生物体的影响。方法:以microRNA-21(简化为miR-21)为例说明构建表达载体的方法。根据microRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共约470个碱基序列,设计PCR引物,PCR扩增,PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒双酶切后,用T4连接酶进行连接反应,并转化入感受态细胞,筛选后对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析,并将其转染Hela细胞,经RT-PCR实验检测其表达情况。结果:pcDNA3.1(+)/miR-21过表达载体转染细胞后使得miR-21在细胞中过表达。结论:成功构建了miR-21的真核表达载体,为进一步研究miR-21功能及作用机制奠定实验基础。 相似文献
17.
目的：克隆人Lumican基因及构建Lumican基因真核表达载体并研究其对人子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖的影响。方法：取人新鲜正常子宫内膜组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增Lumican基因,将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建真核细胞表达载体pEGFP-N1-Lumican,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的Lumican基因通过脂质体介导下转染人子宫内膜癌细胞HEC-1A;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot 检测转染细胞HEC-1A的Lumican mRNA和蛋白表达。采用MTT法观察转染Lumican基因的人子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖能力。结果：重组质粒pEGFP-N1-Lumican经HindⅢ和BamHⅠ酶切,获得8311 bp片段和865 bp插入片段,序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致;荧光显微镜下可见转染的HEC-1A细胞有绿色荧光蛋白的表达;转染细胞HEC-1A的Lumican mRNA表达上调,Lumican蛋白相对上调率为74．62％（P＜0．05）。与对照组细胞比较,转染Lumican 基因的人子宫内膜癌细胞HEC-1A的抑制率为21．35％±2．78％。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Lumican,该载体在体外能有效抑制人子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖能力,为以Lumican基因为靶点研究其对人子宫内膜癌细胞HEC-1A的恶性生物学特性提供实验基础。 相似文献
18.
《中学生理科月刊》1994,(6)
一、境空题（每空4分，共48分）：1.若角α的终边经过点（－5，12），则sinα＝，cosα＝；2．若0°＜α＜β＜90°,则sinα与sinβ产的大小关系是，cosα与cosβ的大小关系是3在△ABC中，若sinA＝cos45°，则A；4．在△ABC中，若C＝90°，AB＝13，AC＝12，sinA＝，cosA＝，tgA＝；5．在△ABC中，若cosA＝sin30°，则A；6．在△ABC中，若c’一a‘＋b’一ah，则iC二；7．在凸ABC中，若a—10，b一10／了，／A—3O”坝u／B一；8．（ig45”－Zoos150o）（ctgl35”＋Zsinl20o）一．二、单项选择题（每小题5分，共20分）：1．在凸AB… 相似文献
19.
《大连大学学报》2016,(6):62-65
本实验旨在构建人核糖核酸酶抑制因子稳定干涉载体pLKO.1-ds RI,为后续观测人核糖核酸酶抑制因子干涉载体的表达对肿瘤细胞的影响奠定基础。用亚克隆法,将针对人核糖核酸酶抑制因子的干涉片段从Simple T-ds RI质粒克隆到pLK-0.1-TRC质粒,用酶切法筛选得到阳性重组质粒pLKO.1-ds RI,用测序法鉴定克隆序列正确。转染时设干扰组、空载体组和空白组三组,每组三次重复。用脂质体CellfectinR将pLKO.1-ds RI(干扰组)、pLKO.1-TRC(空载体组)转染进人肝癌细胞HepG2细胞中,未处理的细胞作空白组。转染后72hr用Western blotting检测细胞中核糖核酸酶抑制因子表达的变化。双酶切鉴定及测序鉴定结果均正确;Western blotting结果表明,对比空白组(1.1578±0.015)和空载体组(1.1216±0.027),干扰组RI表达(0.6119±0.048)明显下调(P<0.05)。结果表明人核糖核酸酶抑制因子干涉载体pLKO.1-ds RNH1构建成功。 相似文献
20.
在已有的pET30a/hs表达载体的基础上，构建了原核表达载体pET30a/hsBLYS(His6)、经双酶切分析和DNA测序后，转化入表达宿主大肠杆菌M15，IPTG诱导后得到高效表达(目的蛋白约占总菌蛋白的35％)；表达产物大部分以包含体形式存在。采用本室自行研制的Ni^2 亲和层析胶(Ni^2 —IDA)纯化可溶部分的重组融合蛋白，经SDS—PAGE鉴定为单一条带。 相似文献